Cellule staminali emopoietiche ed emopoiesi

Inizia con questo numero una breve serie di commenti di colleghi del CRO-IRCCS che riguardano un argomento molto attuale, le cellule emopoietiche staminali. Nel primo articolo la Dr.ssa Donatella Aldinucci ed il Dott. Valter Gattei affrontano alcuni aspetti relativi alla biologia ed al controllo dello sviluppo di queste cellule che sono in grado di dare origine a tutte le cellule del sangue e del midollo osseo.

Verranno anche molto sommariamente illustrati alcuni approcci terapeutici che vengono indicati con il termine generico di ’terapia genica’ che fanno uso di cellule emopoietiche staminali. Seguirà un articolo dei Dott. Alessandro Da Ponte e Luigi De Marco che affronterà la tematica della raccolta e le problematiche connesse alla conservazione delle cellule staminali.

Questo tema è certamente molto vicino e sentito dai donatori ma non va dimenticato che anche i pazienti possono diventare donatori delle proprie cellule staminali per la loro successiva reinfusione senza alcuna modifica o a seguito di trasferimento genico. Infine la Dr.ssa Mariagrazia Michieli tratterà delle vere e proprie applicazioni cliniche connesse all’utilizzo delle cellule emopoietiche staminali e delle malattie in cui si ritiene oggigiorno vi possa essere un maggior beneficio da questo tipo di approccio.

Alfonso Colombatti,
Direttore S.O. Oncologia Sperimentale 2, Dipartimento
di Ricerca Preclinica ed Epidemiologia, CRO-IRCCS, Aviano

CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE ED EMOPOIESI

Le cellule mature del sangue sono destinate a vivere da poche ore a molte settimane, prima di essere sequestrate e distrutte. In un giorno, pertanto, miliardi di cellule devono essere prodotte per rimpiazzare quelle distrutte. Questo enorme processo di rinnovamento cellulare è assicurato da una piccola popolazione di cellule definita come cellule staminali emopoietiche.

Il compartimento emopoietico staminale è in grado di mantenere l’emopoiesi adeguata alle necessità dell’organismo (omeostasi) , sia in condizioni normali che quando si tratti di far fronte ad una aumentata richiesta di cellule del sangue (perdite improvvise di sangue, aumentata distruzione periferica di globuli rossi e piastrine etc). Questo enorme processo di produzione cellulare e di omeostasi viene definito ’emopoiesi’.

La conoscenza dei principali meccanismi che regolano l’emopoiesi è molto importante nella pratica medica. Infatti disordini dell’emopoiesi sono alla base di un certo numero di patologie neoplastiche e non, come leucemie, mielodisplasie, disordini mieloproliferativi, anemie aplastiche ed errori innati del metabolismo. Inoltre la citopenia indotta dalla chemioterapia è una delle prime cause di mortalità nel trattamento del cancro, ma lo studio della biologia dell’emopoiesi ha permesso l’identificazione di alcuni fattori di crescita che riducono il periodo di neutropenia successivo alla chemioterapia.

Quindi capire i meccanismi che regolano la biologia dell’emopoiesi e la ricostituzione del sistema immunitario potrebbero risultare in decremento della mortalità (migliore riuscita) dei trapianti sia autologhi che allogenici.

Cellule staminali emopoietiche e progenitori

Tutte le cellule del sangue sono generate da un piccolo numero di cellule emopoietiche staminali (HSCs) e dai progenitori.

Principalmente le HSCs si trovano nel midollo osseo, ma si possono trovare anche nel sangue periferico, nel sangue da cordone ombelicale, ed in piccolo numero anche nel fegato , nella milza e forse anche in altri organi.

Le cellule emopoietiche staminali sono dotate di bassissima attività proliferative ed assolvono principalmente alla funzione di automantenimento. Poche cellule figlie acquisiscono comunque la capacità a differenziarsi verso una o più linee emopoietiche(cellule staminali commissionate).

Questi progenitori staminali commissionati sono in grado di proliferare e di differenziare ulteriormente ed infine di dare origine a cellule mature. Lo studio dell’ emopoiesi è stato facilitato dalla scoperta di antigeni di membrana che caratterizzano i progenitori emopoietici, quali la glicoproteina CD34 che identifica le cellule appartenenti al compartimento staminale, ed è assente sulle cellule più differenziate.

Emopoiesi

Il processo dell’emopoiesi è costituito da una complessa serie di interazioni fra le cellule del sangue ed il cosidetto microambiente midollare, costitutito principalmente da macrofagi, cellule endoteliali,adipocit e fibroblasti. Queste cellule secernono e sono circondate da una matrice extracellulare (ECM) contenente gli eparan solfatati, il collagene, la laminina, la fibronectina, ed una varietà di altre molecole.

Iprincipali regolatori dell’emopoiesi sono le citochine, cioè sostanze che svolgono la loro azione legandosi ai recettori presenti sulle cellule. Le citochine sono una vasta famiglia di proteine che modulano la quiescenza, l’apoptosi, la crescita ed il differenziamento cellulare. Alcune , quali l’interleuchina 3 (IL-3) ed il GM-CSF inducono proliferazione cellulare, altre quali il flt-3 ligand e lo stem cell factor (SCF) proteggono le cellule dall’apoptosi ed aumentano gli effetti di altre citochine. Inoltre, citochine quali il TNF-a possono avere una duplice azione (attivatoria o inibitoria) a seconda della loro concentrazione.

Questi regolatori dell’emopoiesi possono essere prodotti dalle cellule emopoietiche stesse oppure dalle cellule non emopoietiche che costituiscono lo stroma midollare ed alcuni esistono sia come fattori solubili che come fattori legati alla membrana cellulare .

Le chemochine rappresentano un’altra classe di regolatori dell’emopoiesi. Queste molecole regolano il traffico e l’homing delle cellule del sangue nei siti di bisogno e rappresentano anche dei regolatori (positivi o negativi) della proliferazione. Sono costituiti da una ampia famiglia di composti che regolano processi quali l’infiammazione, la migrazione dei globuli bianchi, l’angiogenesi, la crescita tumorale e le metastasi. Per quanto riguarda l’emopoiesi, le chemochine inibiscono la crescita dei progenitori e ne regolano la migrazione e sono coinvolte nello sviluppo delle cellule T.

Le HSCs ed i progenitori mediante molecole quali integrine, selectine e mucine si legano ad un certo numero di componenti della matrice extracellulare (ECM).

Queste molecole, favorendo l’adesione delle HSCs alle cellule che costituiscono lo stroma o l’endotelio, determinano la colocalizzazione delle HSCs e dei progenitori con un ampio spettro di citochine o altri regolatori (positivi o negativi) della crescita o della morte cellulare programmata (apoptosi).

Nuovi concetti sulla biologia delle HSCc.

Fino a poco tempo fa si pensava che la progenie delle HSCs desse origine unicamente a cellule del sistema emopoietico e che il differenziamento cellulare fosse un processo irreversibile.

In realtà, sembra che la cellula staminale sia molto più ’plastica’ di quanto si potesse immaginare. Studi recenti infatti hanno dimostrato che i progenitori ed anche cellule relativamente differenziate potrebbero ’riprogrammarsi’, nelle giuste condizioni, mediante un processo definito ’plasticità’ trasformandosi in cellule emopoietiche diverse (ad esempio una cellula linfoide si potrebbe trasformare in una cellula mieloide).

Addirittura esistono evidenze sperimentali che le HSCs sono capaci di dare origine a cellule non emopoietiche , quali epatociti, cellule muscolari, neuroni e cellule di altre linee cellulari in presenza di opportune condizioni.

Quindi, un grande numero di meccanismi sembra regolare l’emopoiesi. L’ipotesi della plasticità per la cellula HSCs potrebbe aprire nuovi scenari ponendo le basi per trattamenti innovativi per le malattie degenerative, infiammatorie o per la cura dei tumori.

PARTICOLARI APPLICAZIONI CLINICHE DELLE CELLULE STAMINALI

Terapia genica

Lo sviluppo delle tecniche del DNA ricombinante ha aperto la strada alla possibilità di curare malattie causate da difetti congeniti (fibrosi cistica, deficit di adenosina deaminasi) o acquisiti (neoplasie) tramite opportune manipolazioni del genoma. Il presupposto essenziale per la terapia genica è rappresentato dal trasferimento genico (o transfezione), ossia l’inserimento di un frammento di DNA contenente uno o più geni di interesse specifico, e le sequenze che ne controllano l’espressione, nel nucleo della popolazione cellulare bersaglio.

Impiego clinico del trasferimento genico

La terapia genica consiste nell’inserimento nelle cellule di un gene in grado, almeno potenzialmente, di modificare lo stato di malattia del paziente o di facilitarne la cura. Faremo di seguito alcuni esempi.

’’Gene replacement’’

Con questo termine si intende la sostituzione di un gene mal funzionante o assente con uno integro. I difetti genetici congeniti si prestano più di altri problemi ad essere affrontati con la terapia genica poiché i pazienti sono spesso severamente compromessi e generalmente mancano terapie alternative soddisfacenti.

Le patologie in cui si è avuto il maggiore impulso alla ricerca sono state il deficit di adenosina deaminasi (ADA) che causa una sindrome da immunodeficienza di solito fatale nei primi anni di vita se non si interviene con un trapianto di midollo allogenico.

La terapia genica viene effettuata inserendo il frammento di DNA codificante la proteina di interesse in un vettore retrovirale che successivamente viene utilizzato per modificare le cellule del midollo osseo e del sangue periferico (HSCs), che a loro volta verranno reinfuse al paziente.

Immunoterapia antineoplastica

è possibile ottenere l’espressione di un determinato gene all’interno della cellula in modo tale da modificare lo stato di ’paralisi’ immunologica che il paziente presenta nei confronti della propria neoplasia. Il trasferimento genico può essere effettuato con metodi fisico-chimici o mediante l’uso di virus che fungono da vettori del frammento di DNA del gene da inserire.

Allo scopo di stimolare una specifica risposta immunologica antitumorale si possono utilizzare: a) vettori di espressione codificanti antigeni tumore-associati che sono riconosciuti dai linfociti T citotossici che vengono introdotti nelle cellule tumorali stesse e che conferiscono alla cellula una maggiore immunogenicità, b) vettori di espressione codificanti citochine stimolatorie del sistema immunitario (GM-CSF, IL-2, IL-12) o molecole co-stimolatorie (CD80, CD86, CD40L) che fanno diventare le cellule tumorali a funzione antigen presenting cells (APC) e quindi più immunogeniche. Strategie di trasferimento genico atte a ridurre la tossicità sistemica di farmaci ad attività antineoplastica.Dato che uno dei più importanti fattori limitanti per una chemioterapia ad alte dosi è la tossicità midollare, una possibile strategia di trasferimento genico potrebbe essere quella atta ad aumentare la chemioresistenza delle cellule staminali emopoietiche.

Le cellule del midollo osseo e del sangue periferico possono essere modificate inserendo il gene MDR-1 che conferisce la resistenza ad alcune categorie di antiblastici tra cui le antracicline, gli alcaloidi della vinca, l’actinomicina D ed il taxolo.

Dopo la reinfusione e la ricostituzione, sarebbe teoricamente possibile somministrare ancora terapia antiblastica senza tossicità ematologica apprezzabile.